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Fc受體與流式染色
FcR(Fc受體)是一類能夠和抗體Fc片段特異結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白，不同類型的細(xì)胞可以表達(dá)不同類型的FcR，對應(yīng)和不同結(jié)構(gòu)類型的抗體相結(jié)合，而流式染色用的大多是IgG類型的單克隆抗體，其結(jié)合的Fc受體為FcγR，根據(jù)與抗體Fc片段親和力的強(qiáng)弱可將FcγR分為三個(gè)亞家族：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。
FcγRI主要表達(dá)在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞以及活化的中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。FcγRII有三種形式，FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc，FcγRIIa主要在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC細(xì)胞表面表達(dá)；FcγRIIb主要在髓系細(xì)胞和B細(xì)胞表面；FcγRIIc 主要在單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞表面表達(dá)。FcγRIII 在體內(nèi)有FcγRIIIa和FcγRIIIb兩種亞型，和IgG的結(jié)合力分別為中度和低親和力，FcγRIIIa幾乎在所有白細(xì)胞中表達(dá)；而FcγRIIIb主要在中性粒細(xì)胞中表達(dá)。
在流式染色過程中，如果我們需要染色的細(xì)胞高表達(dá)Fc受體，那么在抗體染色的過程中，抗體的Fc段會(huì)與細(xì)胞表面的Fc受體進(jìn)行結(jié)合，從而產(chǎn)生非特異性的染色背景，最終導(dǎo)致流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性。那么在流式染色過程中如何避免這類結(jié)果的出現(xiàn)呢？
圖1：左邊圖只有抗體與Fc受體結(jié)合產(chǎn)生的信號，屬于假陽性；右邊圖抗體與抗原和Fc受體都有結(jié)合，染色陽性。
方法一：可通過Fc受體阻斷劑（Fc受體抗體），在流式染色抗體加入之前，先加入Fc受體抗體孵育細(xì)胞，將細(xì)胞的Fc受體占據(jù)，這樣后續(xù)加入的流式染色抗體就就很難與Fc受體結(jié)合了。當(dāng)然，并非所有的流式染色都要加入Fc受體阻斷劑，一般我們只針對表達(dá)Fc受體的細(xì)胞并且染色出現(xiàn)異常考慮使用。此外，對于人類細(xì)胞的染色，Fc受體的阻斷并不是特別重要，因?yàn)榱魇娇贵w（動(dòng)物來源的單克隆抗體）與人細(xì)胞的Fc受體結(jié)合效率很低，如果特定情況下出現(xiàn)染色背景，可以考慮使用染色抗體來源物種的血清孵育細(xì)胞，或者用人AB 型血清對細(xì)胞進(jìn)行孵育，這樣會(huì)明顯地阻斷單克隆抗體的非特異性結(jié)合。
圖2：上圖通過加入Fc受體阻斷劑，可抑制染色抗體與Fc受體的結(jié)合
方法二：可通過用同型對照，此時(shí)需要留一管細(xì)胞加入同型對照抗體（與流式染色抗體相同種屬來源，相同亞型，相同標(biāo)記，相同使用量），我們流式染色管的結(jié)果只需以同型對照染色管的結(jié)果為陰性參照。加入的同型對照抗體會(huì)和細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，如果加入的流式染色抗體能產(chǎn)生大于同型對照染色的信號，則說明流式染色結(jié)果是陽性的。
圖3：左圖為Fc受體染色背景，中圖流式抗體染色結(jié)果為陰性，右圖流式抗體染色結(jié)果為陽性。
除了考慮Fc受體的影響外，在活細(xì)胞的表面染色中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均存在吞噬抗體或熒光素發(fā)生非特異性結(jié)合的現(xiàn)象，這個(gè)時(shí)候尤其需要做好相應(yīng)的對照來排除假陽性染色。
1.在瀏覽器的地址欄輸入：www.peprotech.com；
2.根據(jù)產(chǎn)品名稱(如Recombinant Human VEGF165 )或產(chǎn)品編號(Cat#100-20)找到您需要了解的細(xì)胞因子；
3.點(diǎn)擊該細(xì)胞因子的鏈接，向下翻動(dòng)頁面，找到“Cross Reactivity Cited in References (引自文獻(xiàn)的交叉反應(yīng))”欄；
4.在“Cross Reactivity Cited in References (引自文獻(xiàn)的交叉反應(yīng))”欄，可看到Recombinant Human VEGF165(Cat#100-20)已應(yīng)用的種屬，如雞(Chicken)、牛(Cow)、豚鼠(Guinea Pig)、馬(Horse)、人(Human) 、豬(Pig) 、兔(Rabbit)、大鼠 (Rat) 羊(Sheep)、鱒魚(Trout) 和斑馬魚(Zebra Fish)等(見下圖1)。
5.點(diǎn)擊相應(yīng)種屬鏈接如鱒魚(Trout)(如上圖一紅色箭頭所示)，即可查得對應(yīng)參考文獻(xiàn)(見下圖二)。
2.在Web BLAST欄選擇Protein BLAST(如下圖四)。
3.在PeproTech官網(wǎng)輸入100-64，點(diǎn)擊該產(chǎn)品鏈接，找到Recombinant Human EPO的氨基酸序列(如下圖五)。
PeproTech的所有細(xì)胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運(yùn)輸非常便捷，常溫條件即可。而且，細(xì)胞因子和蛋白凍干粉非常穩(wěn)定，在-20℃或-80℃條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系或注射入動(dòng)物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，溶解不好會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實(shí)際使用中經(jīng)常遇到的問題。
那么，應(yīng)該如何進(jìn)行正確的溶解呢？
下面我們以Recombinant Human IL-4 (重組人IL-4，產(chǎn)品編號：200-04)的說明書為例，對細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。
拿到重組人IL-4的說明書后，您會(huì)發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。
1. Centrifuge the vial prior to opening
第 1 步：開蓋前離心試劑管
PeproTech的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會(huì)因顛簸而飄散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。
有很多用戶會(huì)問一個(gè)問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時(shí)間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？
答：有些小型高速離心機(jī)(多為進(jìn)口品牌)的面板上有一個(gè)Spin鍵，按了此鍵后，離心機(jī)會(huì)自動(dòng)快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到最高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個(gè)過程大約30s。這個(gè)Spin鍵足以很好的將細(xì)胞因子或蛋白收集到管底。但有些實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的高速離心機(jī)，只有最高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機(jī)。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達(dá)到類似的效果。
2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.
第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。
這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉
用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-4需用水溶解，而重組人IL-2 (產(chǎn)品編號：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1 (產(chǎn)品編號：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產(chǎn)品編號：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產(chǎn)品編號：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產(chǎn)品編號：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細(xì)胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的官方說明書為準(zhǔn))。后續(xù)的文章中將對各種溶解液的配制方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。
經(jīng)常有用戶會(huì)問，為什么會(huì)有這么多種溶解方法？
答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。PeproTech的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測試，說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？
答：有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時(shí)千萬不能用PBS或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時(shí)用PBS溶解完全沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過最好還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。
2) 一定要溶解到指定的濃度。
蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為0.1-1.0 mg/ml。這個(gè)濃度范圍對于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產(chǎn)品編號：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B(產(chǎn)品編號：120-15)則一定要是0.5mg/ml。
高于或低于該濃度范圍會(huì)有什么問題呢？
答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。
這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。
有用戶會(huì)問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎么辦呢？
答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組蛋白完全溶解。
對于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，PeproTech會(huì)在說明書中進(jìn)行備注(Note)。如在重組人IL-13(產(chǎn)品編號：200-13)的說明書中您會(huì)看到：Slow to dissolve (緩慢溶解)，在重組人IL-11(產(chǎn)品編號：200-11)的說明中會(huì)看到： This solution is slow to dissolve.(該溶液溶解緩慢)。這種情況下，您最好能將要溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時(shí)間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白完全溶解。有些蛋白，如重組人IL-13 Variant (產(chǎn)品編號：200-13A)雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allow the reconstituted vial to sit at 4oC for at > 2 hours before use. (將重懸液在4oC靜置2小時(shí)以上)
3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1 week.
第 3 步：該重懸液在 2-8℃ 最長可保存 1 周。
用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性最長可保持1周。這對一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
其實(shí)，說明書上推薦的濃度對于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4℃保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
4. For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃.
第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白 ( 如 0.1% BSA ，或 10% FBS ，或 5% HSA) 的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于 -20℃ 至 -80℃。
如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
經(jīng)常有人會(huì)在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？
答：不行。我們知道，塑料管壁對多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實(shí)驗(yàn)的人都知道，ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標(biāo)板上的。
載體蛋白，如1% BSA，10% FBS (胎牛血清)和5% HSA等的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞因子或重組蛋白不會(huì)粘附于管壁。如果在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細(xì)胞因子或重組蛋白均會(huì)粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大為降低，最終表現(xiàn)為細(xì)胞因子或重組蛋白活性的下降。 因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。 稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？
答：水不可。該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液(RPMI1640, DMEM等)等。
還有一個(gè)經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？
答：一種方法是訂購PeproTech的小包裝(size A)細(xì)胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。如覺得該方法過于浪費(fèi)，則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。
總之，為保證細(xì)胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中 Reconstitution 的方法嚴(yán)格操作。
