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小鼠胃類器官的培養(yǎng)

發(fā)布時(shí)間：2024-04-24

胃類器官是一種衍生于胃干細(xì)胞或者多能誘導(dǎo)干細(xì)胞的類器官模型，體外培養(yǎng)的胃類器官含有多種細(xì)胞克隆亞群，其培養(yǎng)環(huán)境模擬活體內(nèi)的真實(shí)微環(huán)境，因此胃類器官在細(xì)胞成分、組織構(gòu)架及特定功能等方面與胃上皮組織高度相似，可實(shí)現(xiàn)在體外培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)胃上皮組織的復(fù)制，為人類胃生理與疾病的研究提供了一個(gè)新的平臺(tái)。胃上皮類器官培養(yǎng)的原理就是3D環(huán)境下培養(yǎng)胃上皮干細(xì)胞，加入生長因子和小分子刺激干細(xì)胞自發(fā)分裂、分化形成球囊狀結(jié)構(gòu)。胃上皮腺體可分為胃底/體腺和胃竇/幽門腺兩部分，胃底腺和胃竇腺均可構(gòu)建胃上皮類器官，其中含有的細(xì)胞成分與各自上皮一致。胃類器官是一種非常好的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，目前已被?yīng)用于胃的形成與生理、幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病、胃疾病的致病基因研究、藥物篩選與開發(fā)以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

胃類器官的制備方法

1、小鼠腹腔麻醉后以頸椎脫臼法處死，剖腹，分離胃移至置于冰上的培養(yǎng)皿中。

2、沿胃大彎側(cè)剪開胃壁，冰 PBS 沖洗并分離胃體部。去除胃肌層，將剩下的上皮層剪成直徑小于 2 mm 大小的碎片。用 10 ml 的移液管將組織碎片的移至 15 ml 離心管中，添加 10 ml 冰 PBS反復(fù)吹打重懸，然后讓組織碎片自然沉降于管底，棄去約 7.5 ml 的上清。

3、重復(fù)該重懸清洗步驟 5～10 次至上清液清亮，棄上清。
4、最后一次漂洗后，吸除大部分上清液，向沉淀中加入含 10 mM EDTA 溶液 (25 ml) 室溫消化60 min 后，棄上清。
5、加入 10 ml 冰 PBS 用移液管輕輕吹打幾次，等待組織塊沉淀下去，棄去上清，將組織塊轉(zhuǎn)移到 10 cm2 的培養(yǎng)皿中，在組織塊上覆蓋一個(gè)無菌的載玻片，戴上無菌手套，用兩手的大拇指按壓載玻片，將組織塊腺體中的細(xì)胞擠壓出來。

6、加入 PBS 反復(fù)吹打培養(yǎng)皿和載玻片上的組織塊，吹打后等待組織塊自然沉降，小心吸取上清液并使用 70 μm 濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于干凈的50 ml 管中。
7、如果收集的細(xì)胞不夠多，可以重復(fù)5)和6)步驟，將幾份混合液以 200×g 離心 5 min。小心地倒出并丟棄上清液。

配置類器官培養(yǎng)基

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入(如下表所示)：

培養(yǎng)基中加入的組分及工作濃度

N2 Supplement	1x
B27 serum-free supplement	1x
Murine EGF	100 ng/mL
Murine R-spondin 1	200 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
Wnt -3A	100 ng/ml
FGF10	100 ng/ml
N–acetylcysteine	1 mM
Gastrin I	10 nM
Y-27632	10 μM

注：基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)為Advanced DMEM-F12( 含有 10mM HEPES、L- 谷氨酰胺 )

8、將沉淀重懸于含有冰的類器官培養(yǎng)基中，吸取 10 μL 置于玻璃載玻片或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。使用倒置顯微鏡，計(jì)數(shù)分離的細(xì)胞數(shù)目，200 g 離心 5 min，小心吸出并棄去上清。用類器官培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至 1.6 x105 個(gè) /ml。
9、將離心管置于冰上，吸取 150 μL 重懸好的細(xì)胞懸液，加入等體積的預(yù)冷的 Matrigel，小心地上下吹打十次以充分混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡。
10、吸取 50 μL 懸液，加入到提前預(yù)熱的 24 孔板每個(gè)孔中的中心部位，樣品應(yīng)在每個(gè)孔的中心形成圓頂結(jié)構(gòu)。為了防止接種時(shí)出現(xiàn)氣泡，槍頭內(nèi)液體不要全部打出。分別接種 24 孔板 4 個(gè)孔。
11、將培養(yǎng)板在 37℃下靜置 10 分鐘以待基質(zhì)膠完全凝固。將平板轉(zhuǎn)放入培養(yǎng)箱時(shí)，應(yīng)注意不要破壞凝固后的液滴。
12、使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個(gè)孔中輕輕地加入500 μL室溫(15-25℃)的配置的類器官培養(yǎng)基。不要將培養(yǎng)基從圓頂結(jié)構(gòu)上直接加入。
13、向其它未接種的孔中加入無菌 PBS 以保證培養(yǎng)時(shí)的濕度。
14、將培養(yǎng)板的蓋子蓋好，并在 37℃和 5％CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。
15、每隔 2 天進(jìn)行完全換液。換液時(shí)將移液槍頭放在孔底邊緣小心地將原有液體培養(yǎng)基吸出，并加入為 500 μL 新鮮的室溫類器官培養(yǎng)基。

16、在培養(yǎng)第 7 至 10 天以 1:3~1:6 的比例進(jìn)行類器官傳代，以避免在類器官過度生長和空腔內(nèi)積累過量的碎屑。

小鼠胃類器官的傳代

1、在成熟類器官的24孔板中，每孔加入約1000 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用無菌細(xì)胞刮刮取孔板中的基質(zhì)膠，收集每個(gè)孔中的懸液置于 15 ml 離心管中；
2、將可以傳代的類器官冰上放置 5 ～ 10 min；用 1 ml 大槍頭吹打?qū)⒒|(zhì)膠打碎，吹打 30 下左右，此過程避免產(chǎn)生氣泡（調(diào)制量程到 700 μL可避免氣泡產(chǎn)生），可取適量的懸液觀察，直至大部分類器官結(jié)構(gòu)解離。其后步驟同胃類器官的制備方法中 9 ～ 13。
注：傳代中，若隱窩狀態(tài)良好可進(jìn)行 1:3 傳代，若狀態(tài)較差可進(jìn)行 1:1 傳代。全程可以維持約 3 個(gè)月的長期傳代擴(kuò)增，且類器官狀態(tài)保持良好。

小鼠胃類器官的培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1、胃解剖上可分為胃底、胃體、胃竇、幽門（小鼠胃還擁有前胃部分），對(duì)應(yīng)的胃上皮可以分為胃底 / 體腺和胃竇 / 幽門腺兩部分，兩者在細(xì)胞構(gòu)成上差別較大。它們均含有表面黏液細(xì)胞、頸粘液細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞；但胃底腺含有壁細(xì)胞（分泌鹽酸）和主細(xì)胞（分泌胃蛋白酶），而胃竇腺不含有這兩種細(xì)胞組分。胃底腺和胃竇腺均可以構(gòu)建成胃上皮類器官。胃腺體內(nèi)的干細(xì)胞能夠分裂、分化，自發(fā)形成球囊狀結(jié)構(gòu)；囊壁上含有所有腺體內(nèi)的細(xì)胞成分。囊內(nèi)為上皮的腔面，內(nèi)含脫落細(xì)胞、分泌物等；囊外為上皮的基底面，為細(xì)胞外基質(zhì)成分。

2、EDTA 消化液需要用無鈣無鎂的 PBS 溶液進(jìn)行稀釋，否則影響 EDTA 的螯合作用。

胃類器官的培養(yǎng)相關(guān)試劑及使用濃度

品牌	貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	使用濃度	規(guī)格
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1 mM	10 g/100g
BioGems	1003377	Gastrin I	10 nM	1 mg
BioGems	1293823	Y-27632	10 μM	1 mg/10 mg
PeproTech	315-09	Murine EGF	50 ng/ml	100 μg/500 μg/1mg
PeproTech	250-38	Murine Noggin	100 ng/ml	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	100~500 ng/ml	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	450-61	Murine FGF-10	100 ng/ml	5 μg/25 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-20	Murine Wnt3a	100 ng/ml	2 μg/10 μg

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