一、細(xì)胞準(zhǔn)備篇
1、 組織消化選擇什么消化液，消化多長時間？
答：組織的消化液有兩種，一種是 EDTA, 另一種是膠原酶，EDTA 適合消化空腔性器官，例如小腸和胃；膠原酶消化應(yīng)該比較廣泛，一般會搭配 DNA 酶一起使用，基本適合所有組織的消化。不同組織消化時間差異比較大，從十幾分鐘到數(shù)時小時都有。
2、 消化的溫度如何選擇？
答：EDTA 消化可以在冰上進行，膠原酶的消化需要 37℃，這樣酶的活性最高。
3、 基質(zhì)膠培養(yǎng)之前，如何篩出干性細(xì)胞？
答：如果是單細(xì)胞，并且已知干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，可以通過流式分選或者磁珠分選。
4、 類器官的培養(yǎng)必須要細(xì)胞具有干性嗎？正常組織成熟體細(xì)胞可以做類器官培養(yǎng)嗎？
答：只有干細(xì)胞擴增來源的培養(yǎng)物才能稱之為類器官，因此干性是必要條件。正常組織的成熟體細(xì)胞中往往會有一部分成體干細(xì)胞( 標(biāo)志物為 Lgr5，CD133 等 ), 這部分細(xì)胞可以進行類器官培養(yǎng)。
5、 如何選擇構(gòu)建類器官的來源細(xì)胞？
答：理論上所有類器官都可以選擇從ESC/IPSC 來構(gòu)建，部分類器官可以選擇從組織中分離成體干細(xì)胞來構(gòu)建，成體干細(xì)胞來源的類器官其構(gòu)建周期短，體外傳代次數(shù)多，相對而言構(gòu)建成本低；根據(jù)實驗需求，如果要通過類器官模型來研究器官的發(fā)育，需要對起始細(xì)胞進行基因編輯，一般都是通過ESC/IPSC 來構(gòu)建類器官。
二、類器官培養(yǎng)篇
1、 類器官培養(yǎng)需要多長時間？
答：如果選擇從 ESC/IPSC 來構(gòu)建類器官，需要 1-2 月 ( 甚至更長 ) 才能構(gòu)建成功，如果是選擇從成體干細(xì)胞來構(gòu)建類器官，一般只需要 1-2 周就可構(gòu)建成功。
2、 基質(zhì)膠如何重懸細(xì)胞？
答：用基質(zhì)膠去混細(xì)胞時，可以直接用基質(zhì)膠去重懸細(xì)胞；也可以用培養(yǎng)基：基質(zhì)膠=1:1 的比例稀釋后重懸細(xì)胞，但是不推薦更大比例稀釋基質(zhì)膠，因為加入過多的培養(yǎng)基時，膠滴容易散開，整個重懸過程在冰上操作，重懸細(xì)胞時禁止產(chǎn)生氣泡。
3、 不同孔板培養(yǎng)類器官培養(yǎng)所需的基質(zhì)膠和培養(yǎng)基？
答：類器官常用 24 孔板進行培養(yǎng)，一般種一個 50μl 的膠滴，加入 500μl 培養(yǎng)基覆蓋膠滴；6 孔板可以種多個 50μl 的膠滴，加入 2ml 培養(yǎng)基覆蓋膠滴；96 孔板一般種一個 10μl 的膠滴，加入 200 μl 培養(yǎng)基覆蓋膠滴。
4、 基質(zhì)膠可否反復(fù)凍融？
答：基質(zhì)膠不建議反復(fù)凍融，偶爾凍融一兩次沒問題，多次凍融會有影響，但是要注意，基質(zhì)膠凝固后不建議再用了。
三、類器官傳代篇
1、類器官傳代時如何收獲類器官？如何將類器
官分散開？
答：基質(zhì)膠在 4℃時會變得很軟，吹打后可將基質(zhì)膠分散開，通過離心去除上清液里的基質(zhì)膠，收集的類器官重懸后可通過機械力吹打進行解離；也可以選擇用 Cell recovery solution 來消化基質(zhì)膠，使基質(zhì)膠溶解，通過離心去除上清液里的基質(zhì)膠，Cell recovery solution 對細(xì)胞團消化作用不明顯，因此更多時候類器官傳代需要使用消化酶 ( 包括胰酶 ) 消化成單細(xì)胞或小細(xì)胞團。
2、類器官傳代一般怎么傳??？
答：先把基質(zhì)膠消化掉，可以對類器官消化 ( 消化酶處理 ) 或不消化 ( 機械力吹打 )。傳代通常按照 1:2、1:3、1:4 甚至 1:10 的比例都有傳代成功的例子。需要 37℃，這樣酶的活性最高。
3、如果傳代，有沒有對第一代類器官數(shù)量的要求？
答：由于傳代過程中類器官會有損失，因此類器官傳代時對前一代理論上有一定的數(shù)量要求，如類器官數(shù)量較少、尺寸較小、活性較差等都會影響傳代培養(yǎng)效果。類器官傳代須在類器官數(shù)量較多，且細(xì)胞狀態(tài)較好時進行。傳代時酶解或吹打盡量輕柔以免損傷細(xì)胞。并且傳代操作時盡量避免反復(fù)操作以免造成較大的細(xì)胞損失。
四、腫瘤類器官篇
1、 腫瘤類器官的培養(yǎng)是否也會生成正常的類器官，是否會影響藥敏測試的結(jié)果？
答：腫瘤類器官來源即為腫瘤組織，即使存在部分正常細(xì)胞，也是腫瘤微環(huán)境的一部分，且正常細(xì)胞的干性、增殖能力弱于腫瘤細(xì)胞，因此類器官建立后其大部分細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，少數(shù)正常細(xì)胞基本不會影響藥敏測試。
2、 培養(yǎng)腫瘤類器官需要原始腫瘤組織的大小是多少？活檢樣本量足夠嗎？
答：腫瘤類器官培養(yǎng)所需手術(shù)組織大概需要3 顆黃豆大小以上，穿刺活檢樣本需要至少 3針，內(nèi)鏡活檢至少鉗取 6 顆以上。因腫瘤異質(zhì)性較大，建議可以取腫瘤組織不同部位分別進行類器官培養(yǎng)。
3、 腫瘤類器官培養(yǎng)后能否建系？
答：部分腫瘤類器官是具有長期培養(yǎng)和穩(wěn)定傳代的能力的，這類類器官可用于建系，但不是所有類器官都可以建系。
五、類器官鑒定篇
1. 如何去鑒定培養(yǎng)的類器官是否成功 ?
答：看類器官大小、結(jié)構(gòu)以及是否具有特殊形態(tài)。一般初次培養(yǎng)，最好進行 HE、免疫熒光、基因測序鑒定。
參考文獻：
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